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植物原生质体顽拗现象及其生理和遗传基础研究进展

植物的细胞或组织具有分化成该物种的所有组织或器官的能力。然而,离体培养中普遍存在顽拗现象,即在离体条件下植物组织、器官或细胞丧失了脱分化或分化的能力,不能再生植株。植物原生质体是去除细胞壁后原生质膜所包围的具有生活力的裸露细胞,是获得单细胞无性系、选育突变体及体细胞杂交的优良起始材料。自1971年Takebe和Nagata首次利用烟草叶片分离原生质体并获得再生植株以来,随着原生质体培养体系的不断改进,由原生质体再生成株的植物种类越来越多,其中包括一些难度较大的粮食作物,如禾谷类和豆类[1,2]。然而,一些基因型植物原生质体培养过程中还存在较为普遍的顽拗现象。本文对近年来植物原生质体培养中的顽拗现象及其生理和遗传基础的研究进展进行了综述,以期为顽拗现象的克服从遗传机制上寻找突破口提供参考。
  1原生质体顽拗现象
  利用原生质体进行生物技术育种的先决条件是原生质体能再生完整植株。在原生质体培养过程中,高度分化的细胞要经历细胞壁再生、细胞分裂与生长、愈伤组织形成及植株再生等培养阶段。其中每一阶段能否顺利进行都决定了原生质体培养的成功与否。1971年Takebe等首次利用烟草叶片分离原生质体并获得了再生植株,证实了原生质体的全能性。此后,原生质体培养迅猛发展,研究对象的范围不断扩大,包括果树、林木、药用植物、蔬菜作物、大田作物、牧草等,其中部分植物的原生质体培养体系已经建立[1-4]。然而,在大多数多年生木本和禾谷类等植物中,尽管进行了广泛的研究,但是其原生质体培养仍然困难,只有少数获得了成功,大多数植物表现出顽拗现象。
  除了基因型外,原生质体培养还受外植体类型、培养方式、培养基种类、原生质体植板密度以及外源生长调节剂等多种因素的影响。例如,柑橘叶肉原生质体无论单独培养还是共培养均不能再生,只有胚性愈伤组织来源的原生质体才能再生[5-7]。来源于甘蓝型油菜子叶的原生质体进行固液双层培养最终能够获得再生植株,叶肉原生质体分裂频率低,发生褐化不能得到再生植株[8]。培养条件也会对原生质体培养产生重要影响,烟草NC89叶肉细胞原生质体采用固液双层培养在第一次分裂后能继续分裂并形成大量细胞团,分裂频率达到85.3%,采用固体包埋培养只能进行2~3次分裂,分裂频率只有50.4%[9]。
  2氧化胁迫与原生质体顽拗现象
  植物原生质体在培养过程中会遭遇逆境反应等生理问题,例如细胞壁降解酶是一种逆境诱导剂,因此可以产生活化氧引起脂类过氧化。逆境反应大多数对原生质体制备和培养是不利的,甚至引起原生质体顽拗现象的发生。
  2.1原生质体分离过程中的氧化胁迫
  有研究表明,在燕麦叶片酶解分离原生质体的过程中,原生质体和细胞壁都会产生超氧阴离子,超氧阴离子又会发生歧化作用产生过氧化氢[10]。甘蓝型油菜叶片酶解反应液中积累的过氧化氢含量是正常叶片中的1.5倍,这些活性氧具有很高的反应活性,可对机体产生毒害,破坏生物大分子,影响细胞活性,最终造成原生质体培养过程中细胞的死亡[11]。因此,在酶解过程中可以加入谷胱甘肽来进行保护。酶液的组成也会影响活性氧的产生,切碎或使用单一酶处理烟草叶片不会引发活性氧的产生,用混合酶液酶解烟草叶片产生了大量的超氧阴离子和过氧化氢,在烟草原生质体中检测到了两种活性氧合成酶,一种只能参与超氧阴离子的合成,另一种能够参与所有活性氧合成,而在葡萄原生质体中只检测到了能够参与所有活性氧合成的合成酶[12]。
  2.2原生质体培养过程中的氧化胁迫
  原生质体培养的顽拗现象与原生质体中氧化还原平衡状态有关,原生质体分离的过程中产生活性氧,造成顽拗现象的原因是活性氧清除机制没有启动,抗氧化防御没有被激活,原生质体内是一个低氧化还原状态,抑制了细胞周期的恢复,最终导致了细胞的死亡[13]。谷类植物的叶肉原生质体极其不稳定,在培养的24 h内会发生细胞溶解。用硫代巴比妥酸和硫酸亚铁检测到玉米和小麦原生质体培养中有过氧化物及其降解产物的积累,且谷类植物叶肉原生质体质膜的过氧化反应会抑制原生质体的有丝分裂[14]。大麦叶肉原生质体培养过程中,由于质膜的过氧化反应而产生丙二醛,谷胱甘肽的的含量会减少,这些都是遭受氧化胁迫的表现[15]。烟草叶肉原生质体培养能够获得再生植株,与不能获得再生植株的葡萄叶肉原生质体相比,可溶性蛋白质的含量较高,过氧化物酶的活性显著增强,过氧化物同工酶的种类也较多[16]。烟草原生质体培养能够检测到过氧化氢酶,而葡萄原生质体培养时检测不到过氧化氢酶[17]。
  3原生质体再生能力差异的分子机制
  细胞壁再生是原生质体培养的一个关键阶段。植物细胞壁是一种动态的、有代谢活性的复杂聚合体结构,主要成分包含水、大分子多糖(纤维素、半纤维素及果胶等)、少量蛋白质和仅存在于特异细胞壁(如次生细胞壁)中的木质素。其基本功能不仅表现为决定和维持细胞形状,而且也广泛参与调控细胞生长和分化、抵御生物或非生物胁迫、细胞识别及信号转导等过程[18-20]。细胞壁结构、组分的不同或变化影响植物许多发育过程。例如,果实在贮藏或软化过程中,细胞壁结构、组分及细胞壁酶会发生改变[21,22]。总之,细胞壁合成是植物生长和分化的一个重要过程,细胞壁与植物生命活动的三个基本方面:生长发育与形态建成、物质与能量代谢以及逆境生理都密切相关。
  植物原生质体细胞壁再生过程中,必然伴随某些特殊基因的表达。最近,一些研究以植物原生质体为材料,探讨原生质体细胞壁再生过程中相关基因的表达或相关蛋白质的合成。如Yang等[23]采用抑制性消减杂交技术,分析了棉花原生质体细胞壁再生过程中相关基因的差异表达,获得了412个不同表达序列标签(Expressed sequence tags, ESTs),并成功测序了210条Unigene。Wi■niewska等[24]采用免疫细胞化学反应技术,发现在甜菜(不易再生)和烟草叶肉原生质体(易再生)细胞壁再生过程中,二者在蛋白质表达方面的差异。总之,深入研究原生质体再生细胞壁的组分、相关基因的表达和功能等,有可能揭示原生质体顽拗现象的分子机制。

 
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